Ang IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ay isang analogue ng β-galactosidase substrate, na lubos na na-induce. Sa ilalim ng induction ng IPTG, ang inducer ay maaaring bumuo ng isang complex kasama ang repressor protein, kaya't ang conformation ng repressor protein ay nagbabago, kaya't hindi ito maaaring pagsamahin sa target gene, at ang target gene ay mahusay na naipapahayag. Kaya paano dapat matukoy ang konsentrasyon ng IPTG sa panahon ng eksperimento? Mas malaki ba ang mas mabuti?
Una, unawain natin ang prinsipyo ng IPTG induction: Ang lactose operon (elemento) ng E. coli ay naglalaman ng tatlong structural genes, Z, Y, at A, na nagko-code ng β-galactosidase, permease, at acetyltransferase, ayon sa pagkakabanggit. Hina-hydrolyze ng lacZ ang lactose tungo sa glucose at galactose, o sa allo-lactose; pinapayagan ng lacY ang lactose sa kapaligiran na dumaan sa cell membrane at pumasok sa cell; inililipat ng lacA ang acetyl group mula sa acetyl-CoA patungo sa β-galactoside, na kinabibilangan ng pag-alis ng Toxic effect. Bukod pa rito, mayroong operating sequence O, isang starting sequence P at isang regulatory gene I. Ang I gene code ay isang repressor protein na maaaring magbigkis sa posisyon O ng operator sequence, upang ang operon (meta) ay ma-repress at mapatay. Mayroon ding binding site para sa catabolic gene activator protein-CAP binding site sa itaas ng initiating sequence P. Ang P sequence, O sequence at CAP binding site na magkasama ay bumubuo sa regulatory region ng lac operon. Ang mga coding gene ng tatlong enzyme ay kinokontrol ng iisang regulatory region upang makamit ang koordinadong ekspresyon ng mga produkto ng gene.
Sa kawalan ng lactose, ang lac operon (meta) ay nasa estado ng repression. Sa oras na ito, ang lac repressor na ipinapahayag ng I sequence sa ilalim ng kontrol ng PI promoter sequence ay nagbibigkis sa O sequence, na pumipigil sa RNA polymerase na magbigkis sa P sequence at pumipigil sa pagsisimula ng transcription; kapag mayroong lactose, ang lac operon (meta) ay maaaring ma-induce. Sa operon (meta) system na ito, ang tunay na inducer ay hindi ang lactose mismo. Ang lactose ay pumapasok sa cell at na-catalyze ng β-galactosidase upang ma-convert sa allolactose. Ang huli, bilang isang inducer molecule, ay nagbibigkis sa repressor protein at binabago ang protein conformation, na humahantong sa paghihiwalay ng repressor protein mula sa O sequence at transcription. Ang Isopropylthiogalactoside (IPTG) ay may parehong epekto tulad ng allolactose. Ito ay isang napakalakas na inducer, na hindi na-metabolize ng bacteria at napaka-stable, kaya malawak itong ginagamit sa mga laboratoryo.
Paano matukoy ang pinakamainam na konsentrasyon ng IPTG? Kunin nating halimbawa ang E. coli.
Ang E. coli BL21 na genetically engineered strain na naglalaman ng positibong recombinant pGEX (CGRP/msCT) ay itinanim sa LB liquid medium na naglalaman ng 50μg·mL-1 Amp, at kinultura magdamag sa 37°C. Ang nabanggit na kultura ay itinanim sa 10 bote ng 50mL na sariwang LB liquid medium na naglalaman ng 50μg·mL-1 Amp sa ratio na 1:100 para sa expansion culture, at nang ang halaga ng OD600 ay 0.6~0.8, ang IPTG ay idinagdag sa huling konsentrasyon. Ito ay 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Pagkatapos ng induction sa parehong temperatura at parehong oras, 1 mL ng bacterial solution ang kinuha mula rito, at ang mga bacterial cell ay kinolekta sa pamamagitan ng centrifugation at isinailalim sa SDS-PAGE upang suriin ang impluwensya ng iba't ibang konsentrasyon ng IPTG sa ekspresyon ng protina, at pagkatapos ay piliin ang konsentrasyon ng IPTG na may pinakamalaking ekspresyon ng protina.
Matapos ang mga eksperimento, matutuklasan na ang konsentrasyon ng IPTG ay hindi kasinglaki hangga't maaari. Ito ay dahil ang IPTG ay may tiyak na toxicity sa bacteria. Ang paglampas sa konsentrasyon ay papatay din sa cell; at sa pangkalahatan, umaasa tayo na mas mabuti kung mas maraming soluble protein ang ipinapahayag sa cell, ngunit sa maraming kaso kapag ang konsentrasyon ng IPTG ay masyadong mataas, isang malaking halaga ng inclusion ang mabubuo. Katawan, ngunit ang dami ng soluble protein ay bumababa. Samakatuwid, ang pinakaangkop na konsentrasyon ng IPTG ay kadalasang hindi mas malaki mas mabuti, kundi mas mababa ang konsentrasyon.
Ang layunin ng induction at cultivation ng mga genetically engineered strains ay upang mapataas ang ani ng target na protina at mabawasan ang mga gastos. Ang ekspresyon ng target na gene ay hindi lamang apektado ng sariling mga salik ng strain at ng ekspresyon ng plasmid, kundi pati na rin ng iba pang mga panlabas na kondisyon, tulad ng konsentrasyon ng inducer, temperatura ng induction at oras ng induction. Samakatuwid, sa pangkalahatan, bago i-express at linisin ang isang hindi kilalang protina, pinakamahusay na pag-aralan ang oras ng induction, temperatura at konsentrasyon ng IPTG upang mapili ang naaangkop na mga kondisyon at makuha ang pinakamahusay na mga resulta ng eksperimento.
Oras ng pag-post: Disyembre 31, 2021