Ang Dithiothreitol (DTT) ay isang karaniwang ginagamit na reducing agent, na kilala rin bilang bagong green additive. Ito ay isang maliit na molekular na organikong compound na may dalawang mercaptan group (-SH). Dahil sa mga katangian at katatagan nito sa reducing, ang DTT ay malawakang ginagamit sa mga eksperimento sa biochemistry at molecular biology.
Ang pangunahing papel ng DTT ay ang pagbabawas ng mga disulfide bond sa mga protina at iba pang biomolecule. Ang disulfide bond ay isang mahalagang bahagi ng pagtiklop at katatagan ng protina, ngunit sa ilalim ng ilang mga kundisyon sa eksperimento, tulad ng nababawas na pagsusuri ng SDS-PAGE, rekombinasyon ng protina at pagtiklop, kinakailangang bawasan ang disulfide bond sa dalawang thiol group upang malutas ang spatial structure ng protina. Ang DTT ay maaaring tumugon sa mga disulfide bond upang mabawasan ang mga ito sa mga mercaptan group, sa gayon ay binubuksan ang spatial structure ng protina at ginagawang madali itong suriin at manipulahin.
Maaari ring gamitin ang DTT upang protektahan ang aktibidad at katatagan ng enzyme. Sa ilang mga reaksiyong pinapatakbo ng enzyme, ang aktibidad ng enzyme ay maaaring mabawasan ng oxidant. Ang DTT ay maaaring makipag-ugnayan sa mga oxidant upang gawing hindi nakakapinsalang sangkap ang mga ito, sa gayon ay pinoprotektahan ang aktibidad at katatagan ng enzyme.
Kung ikukumpara sa mga tradisyunal na reducing agent tulad ng β-mercaptoethanol (β-ME), ang DTT ay itinuturing na mas ligtas at mas matatag na reducing agent. Hindi lamang ito matatag sa may tubig na solusyon, kundi napapanatili rin nito ang mga katangian ng reducing nito sa ilalim ng mataas na temperatura at mga kondisyon ng acid-base.
Ang paggamit ng DTT ay medyo simple. Sa pangkalahatan, ang DTT ay tinutunaw sa isang naaangkop na buffer at pagkatapos ay idinaragdag sa sistemang pang-eksperimento. Ang pinakamainam na konsentrasyon ng DTT ay kailangang matukoy ayon sa partikular na eksperimento, at karaniwang ginagamit sa hanay na 0.1-1mM. Ang mas mababang konsentrasyon ay maaaring makabawas sa masamang epekto sa paglaki ng cell at maaaring mabawasan ang cytotoxicity dahil sa labis na ekspresyon ng mga target na protina. Ang mas mataas na konsentrasyon ay maaaring magdulot ng labis na metabolic burden ng cell, na nakakaapekto sa paglaki ng cell at kahusayan sa ekspresyon.
Ang paraan upang matukoy ang pinakamainam na konsentrasyon ay maaaring sa pamamagitan ng pagsusuri sa antas ng ekspresyon ng target na protina sa pamamagitan ng pagsasagawa ng mga pagsubok sa induction ng IPTG sa iba't ibang konsentrasyon. Ang mga pagsubok sa kultura sa maliliit na antas ay maaaring isagawa gamit ang iba't ibang konsentrasyon ng IPTG (hal. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, atbp.) at ang epekto ng ekspresyon sa iba't ibang konsentrasyon ay maaaring masuri sa pamamagitan ng pag-detect sa antas ng ekspresyon ng target na protina (hal. Western blot o fluorescence detection). Ayon sa mga resulta ng eksperimento, ang konsentrasyon na may pinakamahusay na epekto ng ekspresyon ang napili bilang pinakamainam na konsentrasyon.
Bukod pa rito, maaari ka ring sumangguni sa mga kaugnay na literatura o sa karanasan ng ibang mga laboratoryo upang maunawaan ang karaniwang ginagamit na saklaw ng konsentrasyon ng IPTG sa ilalim ng mga katulad na kondisyon sa eksperimento, at pagkatapos ay i-optimize at isaayos ayon sa mga pangangailangan sa eksperimento.
Mahalagang tandaan na ang pinakamainam na konsentrasyon ay maaaring mag-iba depende sa iba't ibang sistema ng ekspresyon, mga target na protina, at mga kundisyon sa eksperimento, kaya pinakamahusay na i-optimize ito sa bawat kaso.
Sa buod, ang DTT ay isang karaniwang ginagamit na reducing agent na maaaring gamitin upang bawasan ang mga disulfide bond sa mga protina at iba pang biomolecule at upang protektahan ang aktibidad at katatagan ng enzyme. Malawakang ginagamit ito sa mga eksperimento sa biochemistry at molecular biology.
Oras ng pag-post: Set-28-2023